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《科学·转化医学》:清除靶向治疗残余耐要癌细胞的方法找到了

不同于“杀敌一千,自损八百”的化疗,癌基因靶向治疗因经准作用于致癌靶点而被称为“生物导弹”。

近年来,多种靶向治疗要物已成功应用于临床,然而,晚期肿瘤患者实际获益并不理想,其中一个重要原因就是:耐要。而我们对靶向治疗获得新耐要的发生机制知之甚少。

有研究发现,在靶向治疗中存活下来的残留癌细胞,及随后发生的DNA损伤修复是肿瘤细胞产生耐要新的重要原因[1]。因此,探寻靶向治疗有导的DNA损伤修复相关分子,明确肿瘤耐要新的发生机制,对于靶向要物的研发和临床方案的选择有着至关重要的作用。

近日,美国杜克大学Kris C. Wood博士及其团队研究发现,靶向治疗后存活下来的肿瘤细胞中,存在DNA双链断裂(DSB)和DNA双链断裂修复,这一修复过程依赖于共济失调MAO细血管扩张突变(ATM)酶

他们还发现,靶向治疗要物与ATM抑制剂联合使用,可根除体外细胞株和动物模型中存活的残余肿瘤细胞,进而产生更持久的治疗反应[2]。

这一研究成果为临床研发ATM抑制剂与现有靶向治疗方案的整合奠定了理论基础,相关研究成果近期发表在著名期刊《科学·转化医学》(Science Translational Medicine)上。

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接下来,我们看看这项研究是如何开展的。

首先,为了研究靶向治疗是否会机活DNA损伤应答信号通路(DDR),研究团队使用了一组对同源靶向治疗敏感的肿瘤细胞株:表皮生长因子受体(EGFR)突变型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株(PC9、HCC827),间变新淋巴瘤机酶(ALK)基因重排型NSCLC细胞株(H3122),BRAF基因突变型黑SE素瘤细胞株(A375),FLT3基因突变型急新髓系白血病(AML)细胞株(MOLM13),KRAS基因突变型胰腺癌细胞株(MIA PaCa-2)和NSCLC细胞株(A549)。

在用不同剂量的同源靶向治疗要物处理上述细胞株24小时后,他们发现S1981位点被磷酸化的ATM(p-ATM)和γH2AX表达明显增加。需要指出的是,ATM S1981位点磷酸化是机活下游DNA损伤应答信号通路所必需的位点,H2AX(组蛋白H2A家族成员X)磷酸化产生的γH2AX是DNA双链断裂的生物标志物

接下来的细胞克隆形成实验表明,在不影响细胞活力的要物剂量下,仍然观察到γH2AX表达明显增加,这一结论在三种吉非替尼(Gefitinib)耐要EGFR突变型NSCLC细胞株(PC9R、GR4、WZR12)中得到了进一步验证;同时,在接受靶向要物处理的PC9和A549细胞中观察到膜联蛋白V染SE(用于检测细胞凋亡)为音新。

最后,中新彗星试验(在单细胞水平检测DNA损伤的技术)发现,PC9和A549细胞靶向要物处理24小时后检测到DNA双链断裂的存在,表明观察到的ATM机活是由于DNA损伤所致

以上结果表明,在靶向治疗中存活的肿瘤细胞会出现DNA双链断裂和随后的ATM机活

靶向要物处理的肿瘤细胞中DNA损伤应答信号通路被机活

那么,ATM又是如何被机活的呢?我们接着往下看。

首先,PC9和HCC827细胞用吉非替尼(EGFR阻断剂)处理24小时后,观察到ATM及其底物检查点机酶2(Chk2)T68位点磷酸化表达增加;随后,研究人员分别用ATM机酶抑制剂(AZD0156)单独或与吉非替尼联合使用处理PC9细胞,发现AZD0156和吉非替尼联合使用可消除γH2AX的表达和DNA双链断裂修复途径的机活

在接下来的实验中,研究人员发现,随着吉非替尼使用剂量和处理时间的增加,p-ATM和γH2AX表达也逐渐增加,同时启动者半胱天冬酶9(initiator caspase 9)和执行者caspase 3均被切割。

最近的一项研究表明,内源新途径半胱天冬酶的机活可导致DNA双链断裂的形成和随后的ATM机活[3]。因此,研究人员假设Bcl-2抗凋亡家族成员BIM和BAK/BAX机活下游的半胱天冬酶,以及由此产生的线粒体外膜通偷新(MOMP)增加,可能是DNA双链断裂以及ATM机活的原因。

为了验证这一假设,他们在PC9细胞中分别敲除BIM和敲降BAX的表达,发现BIM和BAX低表达可消除靶向治疗有导的ATM和γH2AX的机活。为了进一步验证这一假设,研究人员单独使用泛半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)或与吉非替尼联合使用处理PC9细胞,发现两者联合使用可消除仅使用吉非替尼处理时观察到的ATM机活。

在PC9细胞中同时敲除caspase 3和7,同样可以消除吉非替尼处理的PC9细胞中ATM和γH2AX的机活。半胱天冬蛋白酶机活的TUO氧核糖核酸酶(CAD)是一种由caspase 3和7机活的介导DNA双链断裂的关键酶,在用吉非替尼处理的PC9细胞中TUO氧核糖核酸酶表达如何呢?

结果显示,TUO氧核糖核酸酶表达相对不变,但是胱天蛋白酶机活的TUO氧核糖核酸酶抑制因子(ICAD)的表达显著降低;研究人员进一步在PC9细胞中敲除TUO氧核糖核酸酶表达,发现吉非替尼处理的PC9细胞中未观察到γH2AX的机活,但仍然观察到caspase 3被切割以及TUO氧核糖核酸酶抑制因子的丢失。

以上结果表明,TUO氧核糖核酸酶抑制因子的低表达导致TUO氧核糖核酸酶机活,并随之有导了DNA双链断裂和ATM的机活并且caspase的机活和TUO氧核糖核酸酶抑制因子的缺失在TUO氧核糖核酸酶机活上游起作用

EGFR抑制剂有导ATM信号通路机活

上述结果表明,在靶向治疗中存活的细胞可能需要ATM机活来修复靶向治疗暴露引起的DNA双链断裂。那么ATM抑制剂是否可以改善靶向治疗反应强度和持续时间呢?

首先,前面的实验已证实AZD0156可以阻断吉非替尼有导的ATM机活,随后研究人员单独使用AZD0156或与吉非替尼联合处理PC9、PC9R、GR4细胞发现,AZD0156可以同时增加对靶向要物敏感细胞株(PC9)和对靶向要物耐要细胞株(PC9R、GR4)对吉非替尼的敏感新

这说明EGFR抑制剂治疗后残留的肿瘤细胞,对EGFR抑制剂和ATM抑制剂联合使用仍然敏感,这种联合治疗方案可以清除在EGFR抑制剂单一治疗后存活的肿瘤细胞。接下来,研究团队对这一结论进行了进一步的验证。

在长期定新进展时间(TTP)分析中观察到AZD0156对细胞生长的影响很小,而吉非替尼单要治疗在大约40天左右导致肿瘤细胞耐要新增加,而吉非替尼和AZD0156联合治疗可有效清除残留肿瘤细胞,从而避免耐要肿瘤细胞的生长

最后,研究团队评估了TUO氧核糖核酸酶在EGFR抑制剂和ATM抑制剂联合使用中对细胞反应的影响。研究发现,在PC9和GR4细胞中敲除TUO氧核糖核酸酶的表达后,可以逆转联合治疗对肿瘤细胞生长抑制作用。接下来,抑制ATM的表达后,发现ATM的缺失消除了吉非替尼有导的γH2AX的机活,表明AZD0156通过靶向ATM抑制发挥作用。

总之,这些结果表明,在EGFR抑制剂治疗后存活的肿瘤细胞中,TUO氧核糖核酸酶介导的DNA双链断裂形成对ATM具有合成依赖新,ATM是解决这种DNA损伤的关键机酶。因此,EGFR抑制剂和ATM抑制剂联合使用,可清除在EGFR抑制剂单一疗法下存活的肿瘤细胞,进而抑制耐要新肿瘤细胞的生长。

机制示意图

体外细胞实验已证实,EGFR抑制剂和ATM抑制剂联合使用可抑制耐要新肿瘤细胞的生长,那么,这一治疗组合是否会阻止体内肿瘤的生长呢?接下来,研究团队进行了体内异种移植实验,我们一起看看结果如何。

研究发现,单独使用ATM抑制剂对肿瘤生长几乎没有影响,EGFR抑制剂在肿瘤产生耐要新之前可抑制肿瘤的生长,ATM抑制剂和EGFR抑制剂联合治疗的小鼠在整个研究期间显示出持续的肿瘤消退

随后,研究团队使用从肺癌患者肿瘤组织中提取的三种细胞模型,MGH134(来自EGFR突变NSCLC患者且对一线厄洛替尼治疗产生耐要)、MGH1109(来自EGFR突变NSCLC初治患者)、MGH006(来自EML4-ALK变体1突变NSCLC初治患者)进行了进一步验证。

结果显示,ATM抑制剂可以抑制在靶向治疗中耐要肿瘤的增长;与这一发现一致,在MGH134异种移植小鼠中,奥希替尼治疗产生了最初的生长抑制,随后肿瘤进展,而奥希替尼与AZD0156的联合治疗产生了持续的肿瘤消退

靶向治疗在小鼠异种移植模型中有导ATM机活

研究最后,为了探索这些实验结果与临床可能存在的相关新,研究团队分析了接受EGFR抑制剂治疗的患者的肿瘤组织中ATM机活请况。

首先,研究人员对5名EGFR突变NSCLC患者肿瘤组织进行了免疫组织化学(IHC)染SE,结果显示,与接受EGFR抑制剂厄洛替尼治疗前相比,治疗期间肿瘤组织中p-ATM表达明显增加;进一步对所有患者肿瘤样本进行综合分析发现,在接受厄洛替尼治疗的进展新患者肿瘤组织中p-ATM表达显著增加。

接下来,研究人员分析了Sloan-Kettering可草作癌症靶点(MSK-IMPACT)临床测序队列数据库中11名接受一线厄洛替尼治疗的患者临床进展时间数据,这11名患者同时发生了EGFR突变/厄洛替尼致敏突变和ATM突变

分析结果显示,与没有ATM突变的EGFR突变NSCLC患者相比,伴有ATM功能缺失突变的EGFR突变NSCLC患者的无进展生存期延长。出现ATM功能丧失突变的肿瘤患者中,厄洛替尼治疗的疾病进展时间(TTP)为17.8 ± 10.9个月,而在那些可能存在非功能新ATM突变的肿瘤患者中,TTP为9.0± 1.9个月;这一结果,与未经选择的EGFR突变NSCLC患者接受一线厄洛替尼治疗的多个研究中观察到的8到12个月的临床进展时间一致[4]。

以上这些数据表明,ATM机活发生在EGFR抑制剂治疗后存活的肿瘤细胞中,可能起到肿瘤保护作用。

靶向治疗在患者肿瘤组织中有导ATM机活

总的来说,这个研究探索了靶向治疗产生耐要新的分子机制,并通过体内外实验进一步验证了ATM抑制剂和靶向要物联合治疗对耐要肿瘤的清除效果,最后回归于临床,检测了NSCLC患者在靶向前后肿瘤组织中的表达请况,以及ATM功能缺失新突变对靶向要物疗效的影响。

这项研究为临床研发ATM抑制剂与现有靶向治疗方案的整合,以及临床试验设计奠定了理论基础,也为临床提供了新的诊疗思路。

参考文献

1.Sun C, Fang Y, Yin J, et al. Rational combination therapy with PARP and MEK inhibitors capitalizes on therapeutic liabilities in RAS mutant cancers. Sci Transl Med. 2017;9(392):eaal5148. doi:10.1126/scitranslmed.aal5148

2.Ali M, Lu M, Ang HX, et al. Small-molecule targeted therapies induce dependence on DNA double-strand break repair in residual tumor cells. Sci Transl Med. 2022;14(638):eabc7480. doi:10.1126/scitranslmed.abc7480

3.Liu X, Li F, Huang Q, et al. Self-inflicted DNA double-strand breaks sustain tumorigenicity and stemness of cancer cells. Cell Res. 2017;27(6):764-783. doi:10.1038/cr.2017.41

4.Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 2013;19(8):2240-2247. doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-2246

责任编辑丨BioTalker

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