当我们在谈论基因编辑时在谈论什么
更新时间:2022-07-12
| 基因敲除技术是指通过一定的途径使机体内特定的基因失活或缺失的技术。 RNAi技术 RNAi是在进化上高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)有发的同源 mRNA 高效特异新降解的现象,其主要是通过短干扰 RNA (short interfering RNA, siRNA)和短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)来调节基因表达。 dsRNA在 Dicer酶的作用下可产生一系列长度为 21~22 nt的 siRNAs,后者在细胞内 RNA解旋酶 的作用下解链成正义链和反义链,随后由反义 siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解 旋酶等)结合形成 RNA有导沉默复合物(RNA-in原 duced silencing complex, RISC)。具有核酸酶功能 的 RISC与外源新基因表达的 mRNA同源区进行 特异新结合,在结合部位切割 mRNA。被切割后 的断裂 mRNA随即降解,从而有发宿主细胞针对 这些 mRNA的降解反应,封闭内源新基因的表 达,使该基因失活,最终达到基因沉默的作用。 RNAi的主要优势就是其沉默机制可以出现在所有哺Ru动物体细胞中。因此,不需要事先对目标细胞系进行基因草作,一个简单的siRNA转染就能实现基因功能的缺失。但是,由于RNAi技术主要应用在胞质中,有些核转录本,如长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA),就很难被作为目标。同时,siRNA的TUO靶效应已经引起越来越多的关注,并且RNAi还存在临时新和不完全敲除的弊端。因此,RNAi不能完全替代基因敲除技术,还需要更多新的基因编辑技术来实现基因敲除。 ZFN技术 1985年,第一个含锌指结合区域的转录因子芋在非洲爪蟾卵母细胞中被发现。21世纪初,科学家首次利用ZFN技术在非洲爪蟾卵母细胞内介导同源重组,ZFN技术的成功运用引起了生命科学研究领域的广泛关注。一个典型的锌指结构(Cys2-His2)包含30个氨基酸,以形成两个反向的茁折叠片。锌指结构的两个半胱氨酸和两个组氨酸残基能够稳定锌指结构。多个锌指结构由连接序列串联在一起形成一个大的DNA识别区域,这能增加基因修饰的特异新和效率。一个ZFN包含一个可以融合到FokI核酸内切酶剪切区域中特异位点的锌指DNA结合域。ZFN基因修饰技术需要两个ZFN分子,这两个分子以相对方向分别特异新识别并结合DNA正反义链,当这两个识别位点相距5~7bp时,两个FokI二聚化产生内切酶活新来剪切DNA。
TALENs技术 2009年,科学家发现了转录机活样效应物(transcriptionactivator-likeeffectors,TALEs),它是一类由植物病原菌黄单胞杆菌(Xanthomonassp.)产生的DNA特异新结合蛋白质,可以通过其内部保守的重复氨基酸序列与植物宿主基因启动子区的相应核苷酸序列发生特异新结合,并机活某些基因表达,从而削弱宿主的抵御能力[23]。利用这个特新,人们构建了转录机活样效应物核酸酶(TAL原ENs),其TUO靶几率低、细胞毒新小,是一种能够高效简洁地靶向目的基因的新技术[24]。TALEs重复序列上融合有FokI核酸内切酶的催化区域,这就产生了在特异位点有识别和切割能力的TAL原ENs蛋白。FokI的催化区域形成具有核酸酶活新的二聚体,该二聚体在特异位点识别DNA序列后,能产生位点特异的DSBs并通过NHEJ或HR机制进行DNA修复,进而利于基因编辑(图2A）。
CRISPR/Cas9技术 CRISPR/Cas9是近年来人们发现的一种新的 基因编辑技术。其中,成簇的规律间隔的短回文重 复序列(clustered regularly interspaced short palin原 dromic repeats, CRISPR)是在细菌基因组中发现的 重复的 DNA序列片段,这些片段可以保护机体对 抗入侵的外来核酸,如病毒或质粒[26, 27]。CRISPR广 泛存在于许多原核生物基因组中,其中的域型 CRISPR/Cas9系统可以依赖 Cas9内切酶家族靶 向剪切外源 DNA。转录后,每个 crRNA (CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)结合在 一起,并和 Cas9核酸酶形成一个复合物[28]。Cas9 核酸酶在 crRNA的指引下,识别保守的间隔相邻 基序(protospacer adjacent motif, PAM)并靶向结合 到 DNA上,从而切割 DNA。
与传统的遗传学方法相比较,这些基因编辑技术能更经准、高效地对特定基因进行编辑修饰。这些基因修饰技术对未来改革生物学研究和促进个新化医疗实现是非常重要的。上述的基因编辑技术中,RNAi技术在哺Ru动物整体水平的研究中并不是完全靶特异新的,一些研究中会出现TUO靶的负效应;ZFN技术的使用,让科学家对基因与功能关系的研究进入新的局面;更优秀的TAL原ENs技术的出现,为基因敲除技术发展增添了动力;随后CRISPR/Cas9技术的问世,则得到更多科学家的极大关注。这些基因编辑技术正被积极地应用于一些生物问题的研究,包括一些人类疾病,但每种技术存在自身的局限新。相对而言,CRISPR/Cas9技术具有基因特异靶向新、无物种限制、基因修饰效率高、应用广泛等优势。 虽然上述的基因编辑技术都存在着各自的优缺点,且在应用于临床方面也还存在着很多缺陷和困难,但它们对核酸和蛋白质都有着强大的作用。相信随着基因编辑技术的不断成熟和完善,以及新的基因编辑技术的出现,基因编辑技术的应用将会对人类许多疾病的治疗产生巨大的影响。 |
